NAalytics/Assemblies-of-putative-SARS-CoV2-spike-encoding-mRNA-sequences-for-vaccines-BNT-162b2-and-mRNA-1273

关于

RNA疫苗已成为应对当前大流行以及许多其他公共卫生和医疗挑战所带来的挑战的关键工具。 随着COVID-19疫苗的推出，这些合成mRNA已成为众多人群中广泛分布的RNA物种。 尽管这些RNA无处不在，但序列并不总是可用的。 标准方法有助于此类测序。 在本说明中，我们提供了初始Moderna（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32756549/）和辉瑞/BioNTech（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33301246/）COVID-19疫苗的RNA成分的实验序列信息，从而能够进行前者的工作组装并确认先前报道的后一种RNA的序列信息。 共享广泛使用的治疗方法的序列信息的好处是，允许任何使用测序方法的研究人员或临床医生快速识别此类序列是治疗来源的，而不是宿主或传染性的起源。 在这项工作中，RNA是从免疫后留在小瓶中的一小部分疫苗剂量中作为废弃物获得的;否则这些部分将被要求丢弃，并在FDA授权下进行分析以供研究用途。 为了获得鉴定所需的少量RNA，使用TRizol试剂（英杰）对疫苗残留物进行苯酚-氯仿提取，提取前后通过Agilent 2100 BioAnalyser评估完整性。 尽管我们的分析主要集中在丢弃后尽快获得的RNA，但我们也分析了在添加和不添加EPA的情况下冷藏（~4 ℃）长达42天的样本。 有趣的是，在这些制剂中，很大一部分RNA保持完整。 我们注意到，疫苗的配方包括许多关键化学成分，这些成分在这些条件下很可能不稳定--因此这些数据当然并不表明疫苗作为生物制剂是稳定的。 但有趣的是，RNA本身的化学稳定性并不足以阻止最终开发涉及较少的冷链储存和运输的疫苗。 为了进一步分析，通过加热至94℃将初始RNA片段化，用随机六聚尾接头引发，通过模板开关方案（Takara SMARTerer Stranded RN-seq试剂盒）进行放大，并使用MiSeq仪器（Illumina）进行测序，每个末端配对78。 作为特定检测中的参考物质，我们包括已知浓度和序列的RNA（来自噬菌体MS 2）。 从这些数据中，我们获得了有关绞合性的部分信息和一组可用于组装的段。 这对于Moderna疫苗特别有用，在我们的研究进行时，该疫苗的原始疫苗RNA序列尚不可用。 编码全长尖峰的Contigs是从Moderna和辉瑞数据集组装的。 Pfizer/BioNTech数据[图1]验证了该疫苗报告的序列（https：//berthub.eu/articles/posts/reverse-engineering-source-code-of-the-biontech-pfizer-vaccine/），而Moderna序列[图2]无法对照已发表的参考文献进行检查。 缺乏TLR的RNA制剂对于生成疫苗制剂是理想的，因为这些制剂将最大限度地减少脊椎动物对RNA双链特征所产生的戏剧性生物学（和非特异性）反应（https：//www.nature.com/articles/nrd.2017.243）。 在我们分析的序列数据中，我们发现绝大多数读段来自预期的有义链。 此外，少数义读段似乎与有义读段不同，因为缺乏模板转换协议所期望的特征扩展。 仅检查具有明显模板切换的读段（作为来源链的指标），我们观察到两种疫苗都压倒性地产生了有意义读段（>99.99%）。 独立的测序分析和其他实验测量正在进行中，需要确定SmarterSeq协议中的这种模板转换有义读段分数是否确实代表原始材料中的实际TLR含量。 这项工作对两种RNA进行了初步评估，这两种RNA现在是人类生态系统的一部分，并且可能出现在许多其他高通量RN-seq研究中，其中一小部分个体之前可能已经接种过疫苗。 原型致谢：感谢我们同事的帮助和建议（Nimit Jain、Emily Greenwald、Lamia Wahba、William Wang、Amisha Kumar、Sameer Sundrani、David Lipman、Bijoyita Roy）。 图1：从BioNTech/Pfizer BNT-162 b2疫苗组装的编码尖峰的重叠群。 尽管包含了完整的编码区，但用于测序和组装的方法的本质是，组装的重叠群可能缺乏一些